将优化后的LMD技术应用于拟南芥、油菜、花菱草花芽发育期间的四个不同阶段，获取了各个物种花芽组织的高质量转录组数据，解析花芽发育过程中特异表达基因。

  植物的生长发育包括生长、分化两方面，其中生长是发育中的量变，分化是发育中的质变，即产生新的组织和器官。近年来，得益于时空组学和单细胞组学技术的发展，有关植物生长发育的研究也不断取得新的突破。在此，本期遴选了10篇有关植物种子、根系、叶片、茎杆、花序发育的代表性文章并进行精要解读，供了解参考。

  ① 单细胞转录组方法大致上可以分为两大类：一类使用原生质体进行RNA测序，即scRNA-seq，另一类只使用细胞核测序，即sNucRNA-seq（single-nuclei RNA sequencing）；scRNA-seq的结果与基因在植物体内的表达相比仍存在一定的差异，由于scRNA-seq的这些局限性，sNucRNA-seq逐渐被更多地使用。

  ② 相较于激光捕获显微解剖细胞、FACS荧光分选细胞等传统研究方法，植物单细胞转录组学研究可以解析单个细胞基因表达水平的差异，对细胞的异质性、身份和功能提供新的见解。

  ③ 使用已知细胞类型的标记基因注释细胞类型，并通过新的差异表达基因鉴定新的细胞类型，而转录组数据的归类和细胞类型的确定面临着重大挑战，如有些细胞的基因表达缺乏特异性、表达量低或细胞缺乏特异性基因标记。

  ④ 利用单细胞转录组可以轻松又有效地发现和鉴定出稀有细胞类型，例如根的静止中心、侧根的起始细胞，以及未知细胞类型。此外，单细胞转录组还有助于理解细胞特性在发育和响应环境变化过程中的变化（如根细胞对热刺激的响应等）。（寒鹤）

  ① 介绍了分析植物细胞特异性信号网络的常用技术，着重关注了基于液滴的方法，并总结了选择scRNA-seq的关键考虑因素。

  ② 描述了scRNA-seq在植物研究中的应用：首先，一定要通过酶消化去除细胞壁获得原生质体；其次，识别空条形码和双重态是数据分析中的一个关键挑战，需要定义空条形码和非空条形码之间的分界点，并经过控制阈值消除技术和生物变异的进一步来源。

  ④ 概述了scRNA-seq在植物科学中的应用潜力，如利用scRNA-seq数据可以定义基因网络，识别特异性基因表达谱，构建整个组织的发育轨迹；能够适用于解释突变体、自然植物种群表型的新资源等，并指出了当前面临的明显问题，如能否将scRNA-seq技术应用于研究任何植物组织和任何作物。（寒鹤）

  ① 回顾了scRNA-seq在植物叶片研究中的应用进展，从单细胞分离、细胞注释、伪轨迹分析、转录因子调控网络四个方面介绍了相应的可行分析方法，以及当前研究中遇到的相关困难和问题，并对未来植物单细胞转录组研究的发展进行了展望。

  ② 基于FACS（fluorescence-activated cell sorting）可分离特定细胞类型，但不能区分细胞的发育阶段；整合分离原生质体和单核的方法，可捕获特异细胞类型和提高单细胞文库构建效率。

  ③ 通过已知的标记基因、在不一样的物种中使用相似的标记基因、在发育相似的组织区域中使用标记基因、分析特定细胞簇中DEGs编码的细胞功能，以及分析细胞簇之间的相关性等方法来鉴定植物细胞类型。

  ④ scRNA-seq的数据包含同一细胞类型的不同发育阶段，转录组的表达变化随着不同发育阶段的细胞结构和状态的变化而变化，需结合多种细胞类型的scRNA-seq数据来分析细胞的发育阶段和轨迹。

  ⑤ 构建转录因子调控网络不但可以直观地分析转录因子与靶基因之间的调控关系，还可以检测不同转录因子对同一靶基因的调控作用，以及识别潜在的转录因子及调控因子。（寒鹤）

  综述；植物，叶片，scRNA-seq，单细胞分离，细胞类型注释，拟时序分析，转录因子调控网络；Zhixin Liu，Xiaole Yu, Aizhi Qin，Xuwu Sun；河南大学；中国

  ① 分析了大豆种子形态发生过程中3个发育阶段（球形胚时期、心形胚时期和子叶形胚时期）的8个不同组织（胚胎、胚乳、内种皮、表皮、脐、内珠被、外珠被、胚柄）的转录组数据（），在时空水平上研究了大豆种子发育过程中组织特异性的基因表达和调控，为描述大豆种子发育过程中种子组织的结构和功能提供了重要的资源。

  ② 在大豆种子发育过程中，基因表达的组织特异性强于发育阶段特异性，只有3个基因在所有组织中存在一定的差异表达；通过比较大豆和拟南芥种子发育过程中胚和胚乳的差异表达基因，发现了许多预测的大豆种子发育相关调控因子与拟南芥存在同源性。

  ③ 利用加权基因相关网络分析研究11类特征基因表达模式，预测候选转录调控因子，发现了大豆种子发育过程中的基因表达具有较强的时空相关性；分析组织特异性差异表达转录因子的富集情况，发现了转录调控因子的表达具有组织特异性。

  ④ 基因调控网络分析方法预测大豆转录因子AGL96可能是胚乳基因表达的中心调控因子，具有维持种子活性的功能；推测在大豆种子发育过程中，基因表达的组织特异性和该基因的调控因子之间有较高关联性。（Yuki）

  ② 利用了在SEs、CC和PPP中从早期分生组织到分化期细胞表达的新的和现有的荧光标记，采用FACS技术捕获韧皮部极单细胞；再从10,204个细胞转录组数据中确定了韧皮部极中包含的所有细胞类型，并注释为PSE簇、CC簇、PPP簇和MSE簇。并发现了一些新的CC基因：AT2G32210、MAC3（AT5G64240），以及在PSE和CC中表达的基因PLC5（AT5G58690）。

  ③ 使用Slingshot和scVelocity分析了韧皮部细胞图谱的分化轨迹，确认PPP和CC细胞有特定的基因，这些细胞类型共享其发育轨迹的第一阶段；PSE细胞分化轨迹是早期韧皮部细胞的当前轨迹，成熟的PPP和CC的簇包含与去核PSE邻近的细胞。此外，还鉴定出了早期的MSE细胞。

  ④ 整合韧皮部细胞数据与现有的根与叶单细胞数据，发现尽管韧皮部薄壁组织的细胞类型来源不同，但韧皮薄壁组织和成熟周环之间的转录重叠是位置信息对植物细胞功能重要性的另一个标志，加强了PSE作为韧皮组织组织者的作用。

  ⑤ 研究了每种细胞类型的特异性和转录共同点，还鉴定了一组与DOF转录因子结合的DNA，即PINEAPPLEs（PAPL），它们作用于PHLOEM EARLY（PEAR）基因的下游，对于保证在向自养过渡的过程中提供适当的根系营养很重要。（寒鹤）

  ① 首次开发了普适多植物模型的单细胞组合索引双barcode标记法（combinatorial index and dual PCR barcode）的sciATAC-seq技术，成功绘制了13,576个拟南芥根部组织细胞核的染色质开放区图谱。该技术够无偏见地鉴定细胞类型特异性染色质可及性，是一种低成本、高通量的单细胞表观基因组学分析方法。

  ② sciATAC-seq在植物组织中核裂解方法的改进：在用清洁剂裂解植物细胞器之前，在核分离过程加入甲醛固定步骤，以保留核膜并防止在单细胞库准备期间聚集。该处理不可能影响核完整性且能够降低双重速率和消除细胞器DNA污染。

  ③ 与scATAC-seq相比，sciATAC-seq获取的数据细胞器DNA污染较少、双重率低、更多的TN5插入映射到基因启动子区域。对聚合和单细胞信号的分析表明，sciACAT-seq与scATAC-seq产生的染色质可及性曲线，具有相似的质量和可重复性。

  ④ 整合拟南芥根的3个sciATAC-seq数据集和一个snRNA-seq数据集，注释了根的所有细胞类型，并生成了每个细胞簇的染色质可及性图谱，揭示了根的细胞异质性。

  ⑤ 使用sciACAT-seq、scATAC-seq及两部分数据结合，鉴定在bulk和单细胞水平上可访问的染色质区域（accessible chromatin regions，ACRs）的区别，发现了从细胞类型解决的数据中对染色质可及性的访问明显提高了鉴定稀有细胞类型特异性顺式作用调控元件（cis-acting regulatory elements，CREs）的敏感性。（寒鹤）

  ① 研究大白菜抽穗期连续的头叶从内到外的转录组谱，通过在24个不同的叶片组织中展示全基因组基因表达的序列-空间剖面，确定了可能在叶片抽穗中发挥及其重要的作用的关键过渡头叶片，为叶状头部的形成提供了新见解。

  ② 使用RNA-seq分析来自11周大的大白菜外叶和内叶，在全基因组水平上鉴定了不同叶片中的差异表达基因，以探索叶片之间的多样性和潜在功能。

  ③ 鉴定了细胞增殖相关基因和细胞扩张相关基因，细胞增殖基因在不断生长的内叶的起始过程中发挥及其重要的作用，细胞扩张基因的表达模式更多样化，主要调控细胞扩张。

  ④ 通过对叶片发育和糖代谢关键基因的空间表达分析确定了外叶组，并证实外叶是叶球形成的关键过渡叶；关键过渡叶的形成由一个复杂的信号网络控制，不仅包括内部激素和蛋白激酶，还包括外部光和其他刺激。（寒鹤）

  ① 通过RNA-seq分析来自玉米第14个叶片展开阶段和R6阶段的节间样本，共获得伸长阶段（elongation stages，ES）和成熟阶段（maturation stages，MS）的29组（12组ES、17组 MS）58个时空转录组数据，阐明了玉米茎秆发育的时空梯度，并为进一步探究茎秆的伸长发育提供了可靠的数据支持。

  ② 高分辨时空转录组数据被聚类为4个不同的类群（Zone I、Zone II、Zone III、Zone IV），分别对应于4个发育区和9种特定基因表达模式，在茎秆的各个节间中具有不一样的时空表达模式。

  ③ 通过加权基因共表达网络分析，将转录组数据与茎秆表型数据相结合，构建了良好的时空分辨转录调控网络，揭示了决定玉米茎长和厚度的节间维持、伸长和分裂的关键模块和候选基因

  ④ CRISPR/Cas9介导的敲除验证了细胞色素P450基因ZmD1在玉米茎长和厚度方面的调控功能，ZmD1功能的缺失会导致更低的PH值和穗高度、叶片角度放大、开花时间提前、节间增厚，与理想的玉米株型相符。（陈海霞）

  研究文章；玉米，茎秆，伸长，成熟，动态调控网络，时空发育，ZmD1，时空转录组；Liang Le, Weijun Guo, Danyao Du, Xiaoyuan Zhang, Chunyi Zhang, Li Pu；中国农业科学院生物技术研究所，三亚中国农业科学院国家南繁研究院，海南省农业科学院三亚研究院；中国

  ① 首次在单细胞水平解析棉纤维分化起始调控网络及机制，提供了涵盖纤维细胞起始及早期伸长过程（纤维细胞分化、扩散生长和极性生长）的全基因组规模的基因表达图谱，并提出了单个纤维细胞早期发育的分子调控模型

  ② 利用scRNA-seq，从野生型的Xu142_LF棉花纤维起始4个阶段（开花前1.5、1、0.5 d和开花当天）的胚珠外珠鉴定出14,535个细胞，并识别出3种主要的细胞类型，即纤维细胞、非纤维表皮细胞和外色素层细胞。

  ③ 纤维起始可以细分为几个连续但特征明显的过程：胚珠表皮细胞在-1.5 DPA（开花前一天半）时有部分细胞处于前体纤维细胞状态，前体纤维细胞在-1 DPA时分化为纤维细胞，随后开始扩散生长（diffuse growth），在-0.5 DPA时开始突起，然后0 DPA时从转录水平上开始向极性生长（tip-biased diffuse growth）转变。

  ④ 对四个阶段（-1.5、-1、-0.5和0 DPA）样本做了权重基因共表达网络分析，分别得到四个阶段参与纤维起始的转录因子调控网络，揭示了这些过程中分别发挥作用的核心转录因子的时空表达模式。

  ⑤ 基于CRISPR-Cas9的转基因功能验证，将MYB25-like基因定义为作用于纤维细胞分化的“指挥官”，HOX3基因被证明为控制纤维细胞转向极性生长的另一个“指挥官”。（寒鹤）

  研究文章；棉花，胚珠，纤维细胞，基因调控网络，细胞命运转化，scRNA-seq；Yuan Qin, Mengling Sun, Lili Tu；华中农业大学；中国

  ① 针对拟南芥、油菜、花菱草三种被子植物，从植物组织准备、冷冻保护、冷冻切片、激光显微切割、RNA样品制备测序四个方面做了激光显微切割（laser microdissection，LMD）实验流程的优化与验证。该方法广泛适用于其他植物物种，可以在非模型植物物种实现高空间分辨率的转录组分析。

  ② 优化后的LMD流程通过减少组织固定时间，降低真空强度，减少孵育时间、应用LMD膜进行冷冻前保护，提高了整体的实验流程处理速度，简化了冷冻剖面的过程，减少了RNA的降解，增加了转录组测序的成功率。

  ③ 将优化后的LMD技术应用于拟南芥、油菜、花菱草花芽发育期间的四个不同阶段，获取了各个物种花芽组织的高质量转录组数据，解析花芽发育过程中特异表达基因。证实了该办法能够应用于不同植物物种对转录组精细化的时间和空间基因表达分析。（寒鹤）